Nueva visualización in situ en 3D de larvas del gusano del corazón de las focas (Acanthocheilonema spirocauda) en el piojo de las focas (Echinophthirius horridus) por X

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 14078 (2022) Citar este artículo

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El gusano del corazón de las focas Acanthocheilonema spirocauda (Nematoda: Onchocercidae) parasita el corazón y las arterias pulmonares de varias focas fócidas del hemisferio norte. Durante muchas décadas, se han discutido los posibles vectores de este parásito y, hasta la fecha, no se conoce completamente su ciclo de vida. El piojo de las focas Echinophthirius horridus (Anoplura: Echinophthiriidae) es un ectoparásito obligatorio, permanente y hematófago de fócidos que se ha planteado la hipótesis de que funciona como huésped intermediario obligado de A. spirocauda. Examinamos 11 especímenes adultos de E. horridus recolectados de focas comunes varadas (Phoca vitulina) en rehabilitación en el Sealcentre Pieterburen mediante imágenes de rayos X microCT, con el objetivo de ilustrar los sitios de infección de las larvas de A. spirocauda in situ. En tres de estos especímenes se detectaron larvas filiformes en órganos de insectos. Las imágenes detalladas del piojo más infectado revelaron un total de 54 larvas de A. spirocauda ubicadas en cuerpos grasos o en el hemocele. El análisis histológico del mismo espécimen ilustró secciones transversales de nematodos, lo que confirmó los datos de microCT de rayos X. Los datos actuales sugieren firmemente que E. horridus es un huésped intermediario natural de A. spirocauda. Además, demostramos el potencial de las imágenes basadas en microCT de rayos X como un método no destructivo para analizar las interacciones huésped-parásito, especialmente en el campo descuidado de la parasitología de mamíferos marinos.

Acanthocheilonema spirocauda (Leidy, 1858) Anderson, 1992 es un nematodo parásito marino angiotrópico de la familia Onchocercidae (superfamilia Filarioidea)1 que parasita una amplia gama de especies de focas fócidas en el hemisferio norte, incluidas las focas comunes (Phoca vitulina), las focas anilladas ( Pusa hispida) y las focas monje del Mediterráneo (Monachus monachus), en peligro de extinción2,3. En los huéspedes finales, los adultos de A. spirocauda residen principalmente en el ventrículo y aurícula derechos del corazón y en las arterias pulmonares, alcanzando una longitud corporal superior a 20 cm1,2,3,4,5,6. Los estudios epidemiológicos sobre infecciones por A. spirocauda en P. vitulina en libertad en el mar de Wadden mostraron prevalencias variables (32%7, 25%4, 6%5 y 4%6). Las infecciones por A. spirocauda se reportan predominantemente en focas inmaduras4,5,6,8,9 y no parecen afectar significativamente el estado de salud de los animales5,6. Sin embargo, la baja prevalencia de infecciones por A. spirocauda en focas mayores4,5 podría deberse a una alta mortalidad en focas jóvenes gravemente infectadas1,10. Se han descrito lesiones asociadas a A. spirocauda en corazones parasitados, incluso con consecuencias fatales5,10. Por ejemplo, Lehnert et al.5 informaron de una perforación de la aurícula derecha con un marcado derrame pericárdico como causa de muerte en una foca común gravemente infectada.

Durante muchas décadas, se han discutido las vías de transmisión y los posibles huéspedes intermediarios naturales de A. spirocauda; sin embargo, aún no se conoce completamente el ciclo de vida completo (para una revisión, ver Leidenberger et al.1). Las hembras adultas de A. spirocauda son vivíparas y liberan microfilarias en el torrente sanguíneo de los huéspedes finales1. Se ha sugerido la transmisión diaplacentaria de microfilarias, pero debido a las bajas tasas de infección en focas adultas, esta vía no parece desempeñar un papel importante1. Consistentemente, se planteó la hipótesis de que el piojo de las focas marinas hematófago, Echinophthirius horridus (von Olfers, 1816) Fahrenholz, 1919 (Anoplura: Echinophthiriidae) (Fig. 1), podría ser el huésped intermediario obligado natural de este nematodo filarioide1,11. Los representantes de la familia Echinophthiriidae son insectos ectoparásitos obligatorios y permanentes12 y, a diferencia de los anopluranos terrestres, están altamente adaptados a ambientes marinos13. Mientras que varias especies de equinoftiriidos comparten una estricta especificidad de hospedador, el piojo de las focas E. horridus muestra un rango de hospedadores bastante amplio al infestar ocho especies diferentes de focas fócidas, incluidas focas comunes y focas anilladas12. Al igual que A. spirocauda, E. horridus también está restringida al hemisferio norte12 y se presenta principalmente en focas inmaduras6. Debido a sus hábitos alimentarios hematófagos obligados y permanentes, es probable que las especies de equinoftiriidos transmitan y propaguen bacterias transmitidas por vectores, como Anaplasma phagocytophilum, Bartonella henselae, Mycoplasma sp., Rickettsia sp. y Salmonella enteritidis en poblaciones de pinnípedos de vida libre14,15 ,16,17.

Imágenes estereomicroscópicas y de microscopía electrónica de barrido (SEM) del piojo de las focas, Echinophthirius horridus. (a) Vista dorsal y (b) ventral del piojo hembra muy infectado con un área abdominal regordeta y grávida. (c) La probóscide eversible evolucionó para un estilo de vida hematófago. (d) Setas modificadas como órganos sensoriales ubicados en la cuticular. Barras de escala: (a, b) 500 µm, (c, d) 50 µm.

Los nematodos filarios que afectan a humanos y mamíferos terrestres comparten ciclos de vida heteroxenos obligados que involucran a ectoparásitos hematófagos como huéspedes intermediarios18. Dentro del género Acanthocheilonema, la mayoría de los representantes parasitan los tejidos subcutáneos y las cavidades abdominales de huéspedes mamíferos, y se ha informado de una amplia gama de vectores artrópodos competentes, incluidas garrapatas (por ejemplo, Ornithodorus tartakovskyi para A. vitae en roedores19), moscas piojo (por ejemplo, Hippobosca longipennis para A. dracunculoides en perros20) e incluso piojos masticadores y anopluranos (por ejemplo, Heterodoxus spiniger y Linognathus setosus para A. reconditum en perros21). Sin embargo, se sabe muy poco sobre los huéspedes intermediarios de los parásitos filarios que circulan en los mamíferos marinos1,17,22.

Dado que los primeros estudios de los años sesenta y setenta no lograron detectar estadios de A. spirocauda en E. horridus, se asumió que los mosquitos Culex pipiens y las moscas simúlidas eran vectores potenciales10,23. En 1981, Geraci et al.24 lograron por primera vez detectar diferentes estadios larvarios de A. spirocauda en especímenes disecados de E. horridus. Encontraron larvas de A. spirocauda en 70 de 102 piojos obtenidos de un P. vitulina varado, que también mostraba microfilaremia. Los autores describieron cuatro estadios larvarios [microfilarias, larvas de primer estadio (L1), larvas de segundo estadio (L2) y larvas de tercer estadio (L3)], que diferían en tamaño y morfología y se localizaban en el cuerpo adiposo, el tracto gastrointestinal. tracto, el hemocele, las garras y la cabeza de especímenes de piojos disecados24. En los años siguientes, Dailey y Fallace25 presentaron una correlación significativa entre las infecciones naturales por gusano del corazón de las focas y las infestaciones por piojos de foca en focas comunes y Lehnert et al.6 encontraron una única larva de A. spirocauda durante la disección de 35 piojos de foca adultos. El reciente diagnóstico molecular de A. spirocauda en piojos de E. horridus apoyó firmemente la hipótesis de la capacidad vectorial de E. horridus17,26. Sin embargo, el estudio de Geraci et al.24 constituye el análisis más detallado sobre los diferentes estadios larvales y su desarrollo en el piojo E. horridus, representando así el apoyo más convincente de esta hipótesis hasta el día de hoy.

Para la detección de parásitos protozoos y metazoos dentro del tejido de artrópodos, los ectoparásitos se pueden detectar de diferentes maneras, incluidas disecciones6,20,21,24, exámenes patohistológicos27 y el uso de métodos moleculares17,26. En los últimos años, se ha aplicado la técnica de imágenes por microCT de rayos X como método no invasivo y no destructivo para revelar nuevos conocimientos tridimensionales sobre las relaciones huésped-parásito28,29,30,31. Sin embargo, hasta la fecha son escasos los estudios en parasitología médica y veterinaria que utilicen esta técnica de imagen32. Por lo tanto, en este estudio, nuestro objetivo fue contribuir a explorar el papel de E. horridus como huésped intermediario de A. spirocauda mediante el uso de imágenes de microCT de rayos X 3D. Utilizando esta tecnología no destructiva, analizamos especímenes adultos de E. horridus de focas comunes infestadas de forma natural durante su rehabilitación en Sealcentre Pieterburen para detectar la presencia y localización in situ de diferentes estadios larvales de A. spirocauda. La visualización tridimensional de diferentes estadios larvarios y su asignación relacionada con los tejidos debería ayudar a aclarar los distintos pasos dentro del ciclo de vida heteroxeno de A. spirocauda y el papel general de E. horridus como huésped intermediario dentro de los ecosistemas marinos.

Para las imágenes de rayos X mediante microCT, se seleccionaron un total de 11 piojos adultos de Echinophthirius horridus de un conjunto de varios especímenes conservados (n = 53), todos los cuales se originaron a partir de diferentes focas varadas, originalmente de vida libre, durante su período de rehabilitación en el Sealcentre Pieterburen, Países Bajos. Por tanto, se desconocía el estado real de infección de los especímenes conservados de E. horridus. Además, no se disponía de información sobre el estado de infección de las focas por Acanthocheilonema spirocauda (o sobre la presencia de microfilaremia) en el momento del inicio del entorno experimental. Sin embargo, Hirzmann et al.17 mientras tanto demostraron la presencia de ADN de A. spirocauda en el mismo conjunto de piojos E. horridus muestreados. La selección individual de especímenes de hembras adultas para la obtención de imágenes en 3D se basó en aspectos morfológicos (área abdominal rechoncha, dos pares típicos de gonópodos y una longitud corporal de más de 2,5 mm) para aumentar las posibilidades de detectar piojos, que habían chupado extensamente sangre de foca. .

En un primer experimento, se examinaron 11 hembras de E. horridus para obtener una visión general de la morfología de los artrópodos, así como de las características anatómicas, la ubicación y las medidas de los órganos. Dado que este estudio constituye, hasta donde sabemos, el primer análisis de imágenes de microCT de rayos X de piojos equinoftiriidos, se compararon las medidas y los detalles morfológicos de varios órganos de diferentes especímenes de E. horridus. Teniendo en cuenta los microhábitats conocidos de las larvas de A. spirocauda dentro de E. horridus24, se inspeccionaron cuidadosamente los cuerpos grasos subcuticulares y el hemocele de los piojos. Encontramos irregularidades en la densidad de la grasa corporal en tres de los 11 especímenes de E. horridus (27%). Mediante reconstrucción 3D, estas inclusiones heterogéneas en cuerpos grasos se reconstruyeron como estructuras con forma de hilo, a menudo con forma de salchicha, claramente diferenciables del tejido de insecto circundante. Con base en la evidencia genética molecular de A. spirocauda en el mismo grupo de piojos de foca muestreados17 como principal criterio de diagnóstico e identificación, estas estructuras se interpretaron como larvas de A. spirocauda.

En la segunda fase de este estudio, una hembra de E. horridus que presentaba estructuras larvarias llamativas en órganos de insectos fue sometida a imágenes de alta resolución (Figs. 2, 3; Video complementario 1). En total, se detectaron 54 larvas de A. spirocauda con una longitud corporal total de 76 a 1527 µm, de las cuales 45 larvas (83%) se encontraron encerradas y encapsuladas en cuerpos grasos y midieron entre 76 y 779 µm de longitud. Sólo dos larvas localizadas en cuerpos grasos alcanzaron una longitud corporal superior a 600 µm (Fig. 3). En general, las larvas de A. spirocauda presentes en cuerpos grasos parecían fuertemente contorsionadas y mostraban una forma típica de salchicha (Fig. 4). Nueve larvas (17%) se ubicaron libremente en el hemocele y mostraron longitudes corporales de 615 a 1527 µm (Fig. 3). En general, los estadios larvales más largos mostraron una longitud corporal de > 1000 µm (1122–1527 µm, n = 7) y se ubicaron exclusivamente en el hemocele del piojo de las focas.

Análisis de imágenes por microCT de rayos X y reconstrucción 3D de Echinophthirius horridus, con varias larvas de Acanthocheilonema spirocauda (estructuras coloreadas, con forma de hilo o salchicha) en diferentes capas del cuerpo. Visualización in situ. (a) Vista ventral. (b) Vista lateral (c). Vista caudal. Barras de escala: 500 µm. Abreviaturas: a = tracto alimentario, cd = caudal, cr = craneal, lfb = larvas contorsionadas en el cuerpo graso, lh = larvas ubicadas en el hemocele, m = musculatura, r = tracto reproductivo (liendres/huevos), sha = setas modificadas a pelos, tpl = tercer par de patas.

Reconstrucción 3D de Echinophthirius horridus basada en microCT de rayos X que muestra larvas de Acanthocheilonema spirocauda ordenadas por longitud corporal. (a) Vista ventral. (b) Vista lateral. (c) Vista caudal. (d) Descripción general de la localización de las larvas en relación con la longitud del cuerpo. Barras de escala: 500 µm.

Reconstrucción 3D del elemento graso del cuerpo de Echinophthirius horridus. (a) Cuerpo graso marcado de color amarillo, (b) que revela una larva de Acanthocheilonema spirocauda regordeta y con forma de salchicha (potencialmente en etapa L1) en su interior. (c) Cuerpo graso aislado, que contiene larva de A. spirocauda. Barras de escala: 100 µm. Abreviaturas: cu = cutícula, fb = cuerpo graso, sha = setas modificadas a pelos.

Para confirmar que las estructuras en forma de hilos observadas mediante imágenes de microCT de rayos X eran en realidad larvas de A. spirocauda, se sometió al individuo de E. horridus muy infectado a un análisis histológico. Usando secciones semifinas, áreas visibles en los cuerpos grasos de E. horridus y el hemocele revelaron múltiples estructuras en forma de cápsulas que contenían secciones transversales de nematodos. Se pudieron identificar la cutícula de los nematodos y los órganos larvarios internos, incluido el tracto alimentario, la musculatura y las cuerdas laterales (Figs. 5, 6), lo que proporcionó evidencia final sobre la presencia de larvas de A. spirocauda dentro de E. horridus y confirmó los análisis de microCT de rayos X.

Imágenes de microCT de rayos X con estructuras larvarias marcadas y cortes transversales histológicos. Barras de escala: 100 µm. Abreviaturas: cu = cutícula del piojo, fb = cuerpo graso, ha = hemocele, lfb = larvas contorsionadas en el cuerpo graso, lh = larvas ubicadas en el hemocele, m = musculatura, sha = setas modificadas a pelos.

Cortes transversales histológicos que muestran múltiples larvas de Acanthocheilonema spirocauda encapsuladas en cuerpos grasos. Barras de escala: (a, b) 50 µm, (c) 20 µm. Abreviaturas: a = tracto alimentario del nematodo, ca = cápsula, cu = cutícula del nematodo, fb = cuerpo graso, lc = cuerdas laterales del nematodo, lfb = larvas contorsionadas en el cuerpo graso, m = musculatura del nematodo.

Hasta la fecha, sólo unos pocos estudios sugirieron el papel de Echinophthirius horridus como huésped intermediario obligado en el ciclo de vida heteroxeno de Acanthocheilonema spirocauda. Esto se basó en la detección morfológica de diferentes estadios larvales de nematodos (es decir, microfilarias, L1, L2, L3) durante las disecciones de especímenes de E. horridus6,24, una correlación estadística significativa entre las infestaciones con piojos de foca y las infecciones con gusanos del corazón en focas comunes25 y un xenomonitoreo molecular de A. spirocauda en E. horridus17,26. Por primera vez, aquí utilizamos imágenes de microCT de rayos X para visualizar tridimensionalmente las etapas de las larvas de A. spirocauda en sus microhábitats in situ dentro del piojo de foca. De este modo, se detectaron estadios larvales que exhiben diferentes longitudes y localizaciones, lo que demuestra que este nematodo parásito es capaz de desarrollarse en estadios de hasta 1527 µm de largo dentro del piojo foca. Nuestros resultados respaldan el papel de E. horridus como huésped intermediario obligado de A. spirocauda en el ecosistema marino, desempeñando así un papel esencial en la transmisión de patógenos y el mantenimiento de la acantoqueilonemosis en poblaciones de focas en libertad.

Utilizando imágenes de microCT de rayos X no invasivas, se ilustraron varias estructuras parecidas a gusanos dentro de diferentes órganos de E. horridus. El examen histológico de la misma muestra confirmó el diagnóstico basado en microCT de rayos X y demostró que estas estructuras en forma de hilos en el cuerpo adiposo y el hemocele eran en realidad larvas de nematodos. De este modo, la identificación de los nematodos detectados como A. spirocauda se realizó sobre la base del siguiente conocimiento: (i) Las muestras de E. horridus analizadas en este estudio se tomaron durante un estudio de seguimiento de patógenos transmitidos por vectores en piojos de foca y la presencia de A. spirocauda. Se ha confirmado ADN de spirocauda en el mismo conjunto de muestras de E. horridus17. Además del desarrollo de una PCR anidada específica para la detección de A. spirocauda, Hirzmann et al.17 examinaron varios grupos de E. horridus utilizando cebadores pan-filarias para un amplio espectro de nematodos filariales33 y no se pudo detectar ninguna otra especie de filarioide o infecciones mixtas. detectado17 Por lo tanto, esta evidencia genética molecular se utilizó como principal criterio de diagnóstico para la identificación de A. spirocauda en el presente estudio. (ii) A. spirocauda es un endoparásito común de las focas comunes (Phoca vitulina) y la única especie de nematodo filarioide angiotrópico descrita que infecta a las focas comunes en el mar de Wadden4,5,6,7. (iii) Dirofilaria immitis, otro nematodo filarioide18, se describió anteriormente en P. vitulina34, pero nunca se ha detectado en este huésped en el mar de Wadden. Además, se sabe que D. immitis se transmite por mosquitos35 y nunca se ha detectado en piojos equinoftiriidos17.

Otros estudios ya han demostrado el potencial de la microCT de rayos X como método para visualizar y analizar las interacciones huésped-parásito de forma no invasiva y no destructiva28,29,30,31. Destacamos estas ventajas en el ejemplo de un piojo equinoftiriido, hasta donde sabemos, por primera vez en este estudio. Por lo tanto, nuestros datos muestran claramente que las imágenes 3D no invasivas revelan información sobre las estructuras anatómicas detalladas de un ectoparásito de insecto y su fauna patógena potencial, al tiempo que preservan por completo la morfología del insecto. Sin embargo, con este método no es posible un análisis distinto de la morfología larvaria (interna), la clasificación de estadios o incluso la identificación de especies. Utilizando el aspecto no invasivo y no destructivo de esta tecnología de imágenes, estas desventajas y limitaciones podrían igualarse combinando microCT de rayos X con otros métodos de diagnóstico, como disecciones de piojos e identificación morfológica exacta y caracterización de larvas mediante microscopía óptica. Hasta ahora, los análisis de microCT con rayos X rara vez se han utilizado en parasitología médica y veterinaria32. Además, el papel vectorial de la mayoría de las especies de equinoftiriidos constituye un tema de investigación descuidado en el campo de la parasitología de los mamíferos marinos en todo el mundo17, a pesar de que su modus vivendi obligatorio, permanente y hematófago es eminentemente adecuado para la transmisión de patógenos. Demostramos el potencial de las imágenes microCT de rayos X 3D no invasivas para la detección de patógenos en ectoparásitos, que pueden aplicarse a un amplio espectro de investigaciones en entomología médica y veterinaria.

Geraci et al.24 proporcionaron la evidencia más sólida de que E. horridus es un huésped intermediario de A. spirocauda. Detectaron larvas de A. spirocauda en 70 de 102 piojos de foca disecados y clasificaron estos estadios larvarios como microfilarias, L1, L2 y L3, según la longitud del cuerpo y otras características morfológicas24. Las longitudes superpuestas en las mediciones de referencia y las longitudes de las larvas altamente variables en el estudio actual no permitieron la identificación de la etapa de desarrollo en este análisis. Además, la técnica de imagen empleada no pudo detectar distintos parámetros morfológicos utilizados para la identificación del estadio larvario, como una protuberancia cefálica en L1, distintas estructuras internas como el esófago en L2 o estructuras similares a papilas en el extremo posterior de L324, lo que dificulta el estadio. identificación. Curiosamente, en el estudio actual, 16 larvas (con una longitud de entre 76 y 195 µm) tenían menos de 197 µm, un valor medido definido como la longitud corporal mínima de A. spirocauda-L1 por Geraci et al.24. Las etapas L1 también se definieron como etapa de “salchicha”24, término que también se conoce de otros nematodos filarioides, por ejemplo, D. immitis35. Sin embargo, la longitud de las larvas también puede haber sido influenciada por la fijación o la tinción. Por ejemplo, después de la disección de E. horridus, Geraci et al.24 mantuvieron los estadios larvarios en solución salina fisiológica, mientras que las muestras de E. horridus en este estudio se fijaron en etanol al 80% y se tiñeron con solución de Lugol. Se sabe que ambos compuestos provocan la contracción del tejido. Debido a que nuestros datos no fueron corregidos por contracción, los datos presentados sobre la longitud de las larvas deben interpretarse con precaución. Sin embargo, según nuestros datos, las imágenes de microCT de rayos X constituyen una herramienta adecuada para detectar larvas cortas, que podrían pasarse por alto o dañarse durante las disecciones de piojos guiadas por estereomicroscopía. Además, Geraci et al.24 midieron etapas de microfilarias fijadas con formalina al 2% obtenidas de una foca microfilarémica24. Los estadios se encontraron exclusivamente en el tracto gastrointestinal de las muestras examinadas24. Con base en estas observaciones, es posible que los estadios larvarios ubicados en cuerpos grasos, como se encontró en el estudio actual, sean estadios L1.

Al demostrar una alta carga larvaria de A. spirocauda (54 larvas en un solo piojo hembra), los datos actuales resaltan el enorme papel de los piojos equinoftiriidos en la transmisión efectiva de patógenos. En comparación con los datos de Geraci et al.24, la muestra analizada en el presente estudio representa un piojo de foca altamente infectado. Con respecto a la carga parasitaria media, Geraci et al.24 informaron que el 87% de E. horridus infectado albergaba 4,6 estadios L1, el 54% mostró 3,0 estadios L3 y el 26% mostró 1,4 estadios L2. Además, los autores describieron el cuerpo graso del piojo de las focas como la localización principal de las larvas de A. spirocauda; sin embargo, también se encontraron larvas en el tracto gastrointestinal, hemocele, garras y cabeza de especímenes de E. horridus24. En el presente estudio, encontramos estructuras larvarias exclusivamente en los cuerpos grasos y el hemocele de E. horridus. Seis larvas revelaron una longitud corporal de > 1170 µm y, siguiendo los criterios de clasificación de Geraci et al.24, pueden clasificarse como L3. Curiosamente, estas larvas grandes y enrolladas se encontraron exclusivamente en el hemocele.

Incluyendo informes previos de A. spirocauda en piojos de foca6,17,24,26 y datos de otros parásitos filarios35,36,37,38, los resultados del presente estudio contribuyen a desentrañar aún más el ciclo de vida de este nematodo en su huésped intermediario propuesto. . Después de la ingestión de A. spirocauda por parte de E. horridus a través de la ingesta de sangre, las microfilarias necesariamente tienen que abandonar el tracto alimentario para un mayor desarrollo, como es bien conocido en el caso de otros nematodos filaroides, por ejemplo, D. immitis, D. repens o especies de filarias linfáticas35 ,36,37. De lo contrario, el insecto huésped excretará las etapas no migratorias. Al penetrar las membranas del intestino medio, podrían ocurrir microlesiones y daños tisulares, como se informó para las lesiones de membrana en el vector Aedes aegypti causadas por microfilarias de las filarias linfáticas Brugia malayi39. Para Dirofilaria spp., los túbulos de Malpighi del mosquito vector constituyen el sitio de migración favorito de las etapas L1 y L235, mientras que se informó que la musculatura torácica es el microhábitat preferido para los parásitos filariales linpáticos después de la migración desde el intestino medio37,38. Los cuerpos grasos de E. horridus parecen representar un microhábitat preferido, especialmente para las primeras etapas larvarias de A. spirocauda, como informaron Geraci et al.24. Este efecto también se demostró en el estudio actual, que reveló que la mayoría de las larvas (83%) estaban localizadas en cuerpos grasos, mientras que sólo dos de ellas alcanzaron una longitud corporal superior a 600 µm. Al igual que con otros filaroides, se ha demostrado que las etapas de A. spirocauda realizan un enorme crecimiento de longitud en su vector potencial. Geraci et al.24 informaron sobre una longitud hasta diez veces mayor de las etapas infecciosas L3 en comparación con las microfilarias/etapas L1 ingeridas. Considerando las etapas muy cortas detectadas en el estudio actual, la larva más larga del estudio actual (1527 µm) alcanzó la longitud 20 veces mayor que la etapa más pequeña ubicada en el cuerpo graso (76 µm). Sin embargo, para la transmisión a las focas durante la hematofagia de E. horridus, las larvas tienen que migrar aún más hacia la probóscide del piojo, como ocurre con otros vectores35. Como se informó para los taxones de filarias linfarias38, las etapas L3 de A. spirocauda se describieron como muy activas con movimientos vigorosos24, lo que indica una movilidad de migración efectiva fuera del área abdominal en la probóscide del piojo para la transmisión al huésped final de la foca.

En el pasado, se han informado bajas prevalencias de infestaciones por E. horridus (4%5 y 3%6) y por A. spirocauda (6%5 y 4%6) en focas comunes varadas en el mar de Wadden, en Alemania. Sin embargo, Lehnert et al.6 informaron de un claro aumento de la prevalencia de ambos patógenos en focas comunes varadas en el último año del estudio (2013), lo que exige un mayor seguimiento. Dado que la mayoría de los estudios que informan sobre prevalencias bajas de E. horridus5,6 o incluso ningún hallazgo de ectoparásitos4,7,8 se basan en necropsias de focas comunes varadas, se debe considerar que los piojos podrían abandonar su huésped después de la muerte40. Por lo tanto, futuros estudios de prevalencia basados en exámenes de focas en libertad o varadas durante períodos de rehabilitación en centros de rescate de vida silvestre podrían ayudar a comprender mejor la aparición in vivo de esta ectoparasitosis.

Entre los piojos equinoftiriidos, hasta ahora sólo se ha examinado unas pocas especies para determinar su función vectorial14,15,16,17. Hasta la fecha, E. horridus ha sido la única especie de equinoftiriido que se sospecha que funciona como huésped intermediario de una especie de parásito metazoario, concretamente el nematodo filarioide A. spirocauda1,24. No obstante, otra especie de equinoftiriidos también puede estar involucrada en el ciclo de vida de A. spirocauda, como Lepidophthirus piriformis, que infesta específicamente a las focas monje del Mediterráneo en Europa. Esta especie de foca fue registrada recientemente como nuevo huésped de A. spirocauda, ya que se encontraron dos nematodos adultos en el ventrículo derecho de un animal varado3. Sin embargo, no se detectaron ectoparásitos en este informe de caso3. Otro nematodo filarioide marino estrechamente relacionado, a saber, A. odendhali, parasita dentro de las fascias intermusculares y las cavidades corporales de pinnípedos otáridos, como el león marino de California (Zalophus californianus), el león marino de Steller (Eumetopias jubatus) y el lobo marino del norte (Callorhinus ursinus). ). Se considera principalmente no patógeno, pero también incluirá invertebrados hematófagos como huéspedes intermediarios22,41. Sin embargo, el ciclo de vida de A. odendhali es completamente desconocido, por lo que se ha sugerido que los ectoparásitos chupadores de sangre son huéspedes intermediarios obligados22,41. Además, los leones marinos de California y los leones marinos de Steller son huéspedes finales del piojo equinoftiriido Antarctophthirus microchir12, cuyo papel potencial en la transmisión de patógenos nunca ha sido examinado hasta el momento. Curiosamente, los leones marinos de California en libertad y en cautiverio, así como otros otáridos y fócidos, también se revelaron susceptibles a las infecciones por D. immitis34,41. Teniendo en cuenta la amplia gama de hipótesis de transmisión, se necesitan urgentemente estudios futuros sobre el papel vectorial de otras especies de equinoftiriidos para ampliar el conocimiento actual sobre las enfermedades transmitidas por artrópodos en especies de pinnípedos dentro del entorno marino altamente complejo.

Se tomaron muestras de especímenes de Echinophthirius horridus en el marco de un estudio de seguimiento a gran escala de patógenos transmitidos por vectores en el Sealcentre Pieterburen, Países Bajos, a mediados de 201217. El muestreo se realizó exclusivamente durante procedimientos de diagnóstico clínico de rutina en focas comunes varadas, que fueron admitidas para un período de rehabilitación. Usando peines para piojos y fórceps, se extrajeron muestras de E. horridus del pelaje de la foca y luego se almacenaron inmediatamente en EtOH al 80% para investigaciones adicionales. Los procedimientos de admisión y rehabilitación de diferentes especies de focas en el Sealcentre Pieterburen fueron autorizados por el gobierno de los Países Bajos (ID del permiso en el momento de la toma de la muestra: FF/75/2012/015).

La preparación de la muestra incluyó tinción con yodo y montaje de piojos y siguió protocolos establecidos42 con modificaciones menores. Los piojos se fijaron en EtOH al 80%. Antes de la tinción, las muestras se lavaron en agua destilada dos veces durante una hora para eliminar los restos de etanol. Posteriormente, los piojos se colocaron en solución I2KI de Lugol al 1% (Gatt-Koller, Absam, Austria) durante 24 h. Finalmente, las muestras fueron lavadas dos veces en agua destilada durante una hora.

Para el montaje, se sellaron térmicamente puntas de pipeta de 200 µl (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) en la punta y se llenaron con agarosa de bajo punto de fusión (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania). Se calentó agarosa hasta que la viscosidad permitió llenar la punta de la pipeta. Posteriormente, se montaron piojos teñidos en la punta de la pipeta (3 a 4 muestras por punta) utilizando agujas de disección. Era importante mantener distancias estrechas entre las muestras para obtener imágenes de cuatro muestras dentro de un campo de visión, evitando al mismo tiempo los puntos de contacto.

Todas las exploraciones microCT se adquirieron utilizando un XRadia MicroXCT-400 (Carl Zeiss X-ray Microscopy, Pleasanton, CA, EE. UU.). En un primer paso, se adquirieron exploraciones generales utilizando el conjunto de detector 4X (sin agrupación de detectores) con un voltaje de fuente de rayos X de 60 kVp y una corriente de 133 µA. El espectro de rayos X emitido se filtró con el filtro Zeiss LE2. Las imágenes de proyección se registraron en una rotación de 360° con un tiempo de exposición de 30 segundos y un incremento angular de 0,225° entre proyecciones. El campo de visión de las exploraciones generales fue de aproximadamente 5 × 5 mm y cubrió todas las muestras de piojos en la punta de la pipeta. La resolución de vóxel isotrópica en volúmenes reconstruidos de escaneos generales varió entre 2,24 µm y 2,69 µm. Con base en el análisis de las exploraciones generales, se adquirió una exploración de alta resolución del abdomen de una muestra usando el conjunto detector 10X (sin agrupación de detectores) con un voltaje de fuente de rayos X de 40 kVp y una corriente de 200 µA (sin rayos X). filtrar). Las imágenes de proyección se grabaron en una rotación de 360° con un tiempo de exposición de 45 segundos y un incremento angular de 0,225° entre proyecciones. La resolución isotrópica del vóxel en el volumen reconstruido del escaneo de alta resolución fue de 1,09 µm. Todos los volúmenes de imágenes se guardaron en formato DICOM.

Se inspeccionaron exploraciones generales para detectar la presencia de larvas de nematodos utilizando la imagen FIJI J43. La exploración de alta resolución del abdomen de un piojo se importó al paquete de software 3D Amira 2019.4 (FEI SAS, parte de Thermo Fisher Scientific). Para la reducción de ruido, el volumen de la imagen se filtró con dos pasos de filtrado bilateral 3D (paso 1: núcleo = 3 × 3 × 3, similitud = 20 000; paso 2: núcleo = 3 × 3 × 3, similitud = 40 000) seguido de uno paso del filtrado gaussiano 3D (factor de tamaño del kernel = 2, desviación estándar = 1). Las larvas de nematodos se segmentaron manualmente utilizando el Editor de segmentación. Con base en las máscaras de segmentación, se utilizó la herramienta Adelgazante ordenado por distancia (Len of Ends = 8) seguida de la herramienta Trace Lines para la esqueletización con el fin de extraer un gráfico espacial para cada larva. Los gráficos espaciales se suavizaron utilizando la herramienta Conjunto de líneas suaves (suavizado = 0,8, adherirse a los datos originales = 0,05, número de iteraciones = 100). Finalmente, utilizamos la herramienta Estadísticas de gráficos espaciales para medir la longitud de los gráficos espaciales. Para la visualización, utilizamos ambas superficies generadas a partir de las máscaras de segmentación junto con la representación del volumen del abdomen del piojo, así como una visualización de gráficos espaciales codificados por colores según la longitud.

Para los análisis histológicos, la muestra se cortó en dos pedazos aproximadamente en la región del tórax para asegurar una adecuada infiltración de resina. Las piezas obtenidas fueron posteriormente deshidratadas en una solución acidificada de dimetoxipropano, seguido de varios enjuagues en acetona pura antes de iniciar la infiltración en resina Agar Low Viscosity (Agar, Stansted, Essex, Reino Unido). Después de la inclusión y polimerización de la resina, se realizaron cintas de secciones en serie con una cuchilla de diamante Diatome HistoJumbo (Diatome, Suiza). Las secciones se tiñeron con azul de toluidina, se sellaron y luego se fotografiaron y analizaron con un microscopio compuesto Nikon NiU equipado con una cámara microscópica Nikon DsRi2 (Nikon, Tokio, Japón). Las secciones en serie se convirtieron a escala de grises utilizando FIJI43 y luego se importaron al software de visualización 3D Amira (Thermo Fisher). Las imágenes se alinearon utilizando el módulo AlignSlices de Amira. Posteriormente, se colocaron secciones virtuales de la pila de TC de la muestra parasitada y reconstruida utilizando las secciones histológicas como referencia para comparar la información de la TC con los detalles histológicos.

El gobierno de los Países Bajos autorizó el procedimiento de admisión y rehabilitación de diferentes especies de focas en el Sealcentre Pieterburen (ID del permiso en el momento de la toma de la muestra: FF/75/2012/015).

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Descargar referencias

Agradecemos el apoyo del Sealcentre Pieterburen durante los procedimientos de toma de muestras. Además, nos gustaría agradecer a Annika Seipp (Instituto de Anatomía y Biología Celular, Universidad Justus Liebig de Giessen) por su ayuda durante la microscopía electrónica de barrido. Esta investigación se financió con recursos del VetCore Facility (VetImaging) de la Universidad de Medicina Veterinaria de Viena. Este estudio está dedicado a Madita, una joven alegre y amante de la naturaleza, entusiasta de los animales marinos y auténtica inspiración para su padre.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto de Parasitología, Centro de Investigación Biomédica Seltersberg, Universidad Justus Liebig Giessen, Schubertstr. 81, 35392, Giessen, Alemania

David Ebmer, Anja Taubert & Carlos Hermosilla

Centro VetCore para la investigación, Unidad de imágenes, Universidad de Medicina Veterinaria de Viena, Veterinaerplatz 1, 1210, Viena, Austria

Stephan Handschuh y Martin Glösmann

Departamento de Biología Evolutiva, Universidad de Viena, Djerassiplatz 1, 1030, Viena, Austria

Thomas Schwaha

Sealcentre Pieterburen, Hoofdstraat 94a, 9968 AG, Pieterburen, Países Bajos

Ana Rubio-García

Instituto de Anatomía y Biología Celular, Universidad Justus Liebig Giessen, Aulweg 123, 35385, Giessen, Alemania

Ulrich Gartner

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CH y DE diseñaron y conceptualizaron el estudio. DE preparó muestras, analizó datos, redactó el manuscrito y preparó figuras. SH realizó análisis de microCT de rayos X y analizó conjuntos de datos. TS realizó análisis histológicos. AR-G. Realicé y supervisé el proceso de toma de muestras. UG realizó microscopía electrónica de barrido. MG y AT revisaron críticamente el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito antes de enviarlo.

Correspondencia a David Ebmer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Vídeo complementario 1.

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Ebmer, D., Handschuh, S., Schwaha, T. et al. Nueva visualización in situ en 3D de larvas del gusano del corazón de las focas (Acanthocheilonema spirocauda) en el piojo de las focas (Echinophthirius horridus) mediante microCT de rayos X. Representante científico 12, 14078 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18418-y

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Recibido: 07 de junio de 2022

Aceptado: 10 de agosto de 2022

Publicado: 18 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18418-y

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